Misi Puskesmas adalah langkah-langkah yang akan diambil untuk mewujudkan visi Puskesmas. Adapun misi untuk mencapai visi UPT Puskesmas Pulo Ampel adalah dengan :

1. Terpenuhinya sarana dan prasarana pelayanan kesehatan yang terstandar sesuai dengan perkembangan teknologi;
2. Memelihara dan meningkatkan mutu pelayanan, terjangkau dan merata di wilayah kerja;
3. Mendorong kemandirian hidup sehat bagi keluarga dan masyarakat;
4. Memelihara dan meningkatkan kesehatan perorangan, keluarga, masyarakat dan lingkungan.

Menciptakan lingkungan sehat yang merupakan sumber kesehatan perorangan, keluarga dan masyarakat dapat dicapai dengan mengoptimalkan kegiatan promkes dan kesling serta meningkatkan kerjasama lintas program dan lintas sektor.